Pesquisa de fungos filamentosos a partir de Cannabis sativa L. (Maconha) em uma pericia criminal

A Cannabis sativa L. é uma planta produtoras de substâncias psicoativas, classificada como planta proscrita por conter essa propriedade. Ela é conhecida popularmente com maconha ou marijuana.

Em planta herbaceae constituída de flores femininas maturas e compostas por folhas pistiladas. A forma resinosa, conhecida como haxixe, consiste fundamentalmente de tricomas glandulares coletados do mesmo material vegetal.

O principal composto químico psicoativo presente na cânabis é o Δ9-tetrahidrocanabinol (delta-9-tetrahidrocanabinol), comumente conhecido como THC - cuja concentração média é de até 8%, mas algumas variedades de maconha (cruzamentos entre a espécie Cannabis sativa e a Cannabis indica) comumente conhecidas como skunk ("cangambá", em inglês) produzem recordes na marca de 33% de THC. Pelo menos 66 outros canabinóides estão presentes na Cannabis, como ocanabidiol (CBD) e o canabinol (CBN), muitos dos quais causam interações psicoativas.

Fungos filamentosos são conhecidos também como bolores em que constituem vários gêneros como Aspergillus spp., Penicillium spp., Scopulariopsis spp., Chysosporium spp.

A maioria dos fungos desenvolve-se como hifas, que são estruturas filamentosas, cilíndricas, com 2 a 10 µm de diâmetro e até vários centímetros de comprimento. As hifas crescem nas suas extremidades (ápices); novas hifas formam-se tipicamente por meio da emergência de novas extremidades ao longo da hifa existente num processo designado “ramificação”, ou ocasionalmente por bifurcação de extremidades de uma hifa em crescimento, dando origem a duas hifas com crescimento paralelo. A combinação do crescimento apical com a ramificação/bifurcação conduz ao desenvolvimento de um micélio, uma rede interconectada de hifas. As hifas podem ser septadas ou cenocíticas: as hifas septadas são divididas em compartimentos separados por paredes transversais (paredes celulares internas, chamadas septos, que se formam perpendicularmente à parede celular, dando à hifa a sua forma), cada compartimento contendo um ou mais núcleos; as hifas cenocíticas não são compartimentadas.

CAZENAVE, 2003 faz o levantamento de fungos filamentosos em prensados de Cannabis sativa L. (Maconha), realizado no Instituto Médico Legal de Campinas-SP. Seu trabalho constitui de uma importância tanto epidemiológica como para perícia forense. O trabalho busca orientar os profissionais que estão em contato com a planta durante sua apreensão e identificação, assim como os seus usuários, pois ambos os tipos de exposições podem levá-los manifestações de sintomas que vão de alergias a intoxicação devido aos esporos e hinfa dos fungos.

Os fungos mais freqüentes identificados em sua pesquisa foram: Aspergillus sp, Fusarium sp, Penicillium sp, Cephalosporium sp e Cladosporium sp.

A técnica de cultivo foi realizada com utilização de meio de cultura Agar Saboraud Dextrose em placa de Petri 90 x15 com 20 ml e 5 ml em tubos 10 x 15 inclinado para a sua manutenção das cepas e nova análise, o mesmo processo de manutenção também corresponde a Cadeia de Custódia, onde as provas de um delito são guardadas sob responsabilidade da Secretaria de Secretaria de Segurança Pública em quanto corre o processo judicial.

As colônias foram isoladas e identificadas com técnicas tradicionais em microbiologia e micologia tanto microscópica como macroscópica.

Fonte de pesquisa:

CAZENAVE, S.O.S., Isolamento e identificação de fungos filamentosos a

partir de “Cannabis Sativa l.”. Revista de Toxicologia em Línea nº 03 p. 01 - 12 dezembro 2003.

http://www.anvisa.gov.br/legis/portarias/344_98.htm

http://pt.wikipedia.org/wiki/Maconha

http://pt.wikipedia.org/wiki/Fungi#Morfologia

Isolamento de Escherichia coli O157:H7 em pericia de alimentos processados derivados de carne animal.

Colônias de Escherichia coli enter-hemorragica em agar McConkey com Sorbitol (Fonte de pesquisa:http://madscientistjunior.blogspot.com/2009_03_01_archive.html)

“Kim Reggis, conceituado cirurgião cardíaco dos USA, leva sua filha adolescente Becky Reggis para jantar fora em uma lanchonete badalada da sua região, a Onion Ring. Após terem comido um hambúrguer malpassado, sem saber que naquele hambúrguer se encontrava uma das formas mais patogênica da espécie bacteriana Escherichia coli O157:H7, produtora de uma toxina mortal.

A pequena Becky passou a sentir dores abdominais no dia seguinte e cada dia que passava se agravava mais os sintomas de mal estar. Incapaz de impedir a progressão da doença, ele se lança em uma investigação solitária para descobrir como e por que sua filha ficou doente. “A trilha de pistas leva às grandes industriais de carne e suas práticas assustadoras.” Livro: TOXINA – Robin Cook, editora Record Rio de janeiro, 1999.

A Escherichia coli é uma enterobactéria Gram-negativa comum no intestino animal. Cerca de 200 E.coli patogênicas conhecidas podem causar doenças diarréicas e infecções do trato urinário, que representam risco de vida. Linhagens de E.coli entero-hemorrágica (EHEC) produzem verotoxina, uma enterotoxina semelhante ao da bactéria Salmonella dysenteriae, a toxina Shiga. Após a ingestão de alimentos ou água contaminada com uma linhagem específica de EHEC, Escherichia coli O157:H7, o microrganismo se desenvolve no intestino delgado, onde produz a Verotoxina. Tal toxina provoca diarréia hemorrágica e insuficiência renal em crianças. A cauda mais comum dessa infecção corresponde ao consumo de carne crua ou mal cozida contaminada, principalmente carne moída processada em massa. Uma das principais formas de contaminação dessas carnes é na hora do abate no matadouro, em que o material intestinal entra em contato com a carne.

Já foram vários trabalhos científicos referente a pesquisa de E.coli O157:H7 em alimentos a base de carne moída processada para o consumo da população, principalmente adolescentes e crianças.

Uma das ferramentas utilizadas em laboratório para o cultivo deste patógeno é o meio de cultura McConkey com Sorbitol. Seu isolamento corresponde em semear o material questionado em Agar McConkey com sorbitol, incubar em estufa bacteriológica por 18 a 24 horas em atmosfera de CO₂. Seu resultado é interpretado pela presença de colônias rosa para vermelho, em que representa bactérias sorbitol positivo, pois a Escherichia coli entero-hemorrágicas são bactérias fermentadoras de sorbitol. É utilizado também o meio de cultura McConkey com Sorbitol suplementado com antibióticos, tais como cefixima, suplementado com cefixima e telurito. Outro método para a identificação laboratorial de cepas de Escherichia coli O157:H7 é a utilização da prova para a detecção do sorotipo O157 ou toxina tipo SHIGA diretamente nos materiais questionados.

Segundo TAVARES, 2006 pesquisou sobre os aspectos microbiológicos das carnes de Hambúrgueres prontas para o consumo, onde a característica comum da microbiota da carne bovina em condições higiênicas é composta por bacilos Gram-negativos como as da família das Enterobacteriaceae e do gênero Pseudomonas e por Gram-positiva dos gêneros Enterococcus, Lactobacillus e Staphylococcus. As bactérias patogênicas mais comuns encontradas nestes alimentos são Escherichia coli, Clostridium perfrigens, Staphylococcus aureus e Salmonellas spp. e ocasionalmente Yersinia enterocolitica, Clostridium butolinum e Bacillus cereus. A Escherichia coli O157:H7 é isolada com mais freqüência em hambúrgueres contaminados implicados em surtos infecciosos de origem alimentar.

A população atual devido ao pouco tempo disponível para a preparação de alimentos saudáveis, tem se apegado a alimentos industrializados para consumo rápido e barato como os hambúrgueres de carne bovina, tornou opção freqüente entre a população, principalmente jovens que freqüentam lanchonetes, Traillers de praça e lotre públicos, assim como redes fast food.

Segundo a Legislação do Código Penal Brasileiro Lei 9.677/1998:

ART.: 272 Corromper, adulterar, falsificar ou alterar substância ou produto alimentício destinado a consumo, tornando-o nocivo à saúde ou reduzindo-lhe o valor nutritivo:"(NR).

Referências Bibliográficas:

COOK,R - TOXINA- Editora Record Rio de Janeiro, 1999.

KONEMAM,E – DIAGNÓSTICO EM MICROBIOLOGIA: ATLAS E TEXTO 5ª Ed. Editora Medsi, Rio de janeiro, 2001. P.205 e 206.

TAVARES, T, M – CARNES DE HAMBURGUERES PRONTAS PARA CONSUMO: ASPECTOS LEGAIS E RISCO BACTERIANO. Revista Patologia Tropical Nº 35(1): 1-25. jan.-abr. 2006.

Site pesquisado: http://www.planalto.gov.br/ccivil/leis/L9677.htm

Trichomonas Vaginalis: Parasita de importância forense indicadora de crime sexual

A genética forense tem se mostrado uma forte ferramenta para a identificação de suspeitos de crimes sexuais, principalmente quando há o óbito da vítima, onde serão coletados vestígios deixado pelo mesmo na vítima. Mas quando a vítima sofre apenas o abuso pelo agressor? Quando a vítima por distúrbio nervoso toma algumas atitudes, em que possa eliminar alguns vestígios do criminoso em seu corpo, como um banho?

A microbiologia forense pode complementado essa lacuna, mostrando que se pode enriquecer uma investigação de crimes sexuais com pesquisas de bactérias, fungos e parasitas encontradas os orgãos genitourinário, tanto da vítima, quanto do agressor.

Dentre estes microorganismo a Trichomonas vaginalis pode se tornar um bom bioindicador desse tipo de delito.

O Trichomonas vaginalis é um parasita eucariota flagelado anaérobio facultativo com cerca de 15 micrômetros. Tem 4 flagelos desiguais e uma membrana ondulante que lhe dão mobilidade, e uma protuberância em estilete denominada axóstilo --- uma estrutura rígida, formada por microtúbulos, que se projeta através do seu centro até sua extremidade posterior. Não possui mitocôndrias, mas apresenta grânulos densos (hidrogenossomos) que podem ser vistos à microscopia óptica. Essas estruturas são portadoras da enzima piruvato:ferredoxina oxirredutase, a qual transforma piruvato em acetato por oxidação fermentativa, liberando energia na forma de ATP. O T. vaginalis é o agente causador da tricomoníase. Existe em apenas uma única forma (trofozoíto), que é simultaneamente infecciosa e ativa. Contudo formas arredondadas com flagelos internalizados muito semelhantes a cistos, porém sem apresentar parede cística são comumente encontradas. Estas formas são conhecidas como pseudocistos. Ao contrário do que se imaginavam os pseudocistos não são formas degenerativas, mas sim formas funcionais e metabolicamente ativas. Reproduz-se por pleuromitose fechada com fuso extranuclear. Cresce em pH entre 5,0 e 7,5 a temperaturas variando de 20 a 40 °C. Utiliza a glicose, a maltose e a galactose como fontes de energia. Mantém o glicogênio como forma de armazenamento de energia. Em condições adversas, podem utilizar também os aminoácidos, especialmente a arginina, treonina e leucina, como fontes energéticas.

Doença infecto-contagiosa do sistema gênito-urinário do homem e da mulher. No homem causa uma uretrite de manifestações em geral discretas (ardor e/ou prurido uretral e secreção brancacenta, amarelada ou amarelo esverdeada), podendo, eventualmente ser ausentes em alguns e muito intensas em outros.
É uma das principais causas de vaginite, vulvovaginite e cervicite (infecção do colo do útero) da mulher adulta podendo porém, cursar com pouca ou nenhuma manifestação clínica. Quando presente, manifesta-se na mulher como um corrimento vaginal amarelo esverdeado ou acinzentado, espumoso e com forte odor característico. Não é incomum também ocorrer irritação na região genital bem como sintomas miccionais que podem simular uma cistite (dor ao urinar e micções frequentes).
Transmissão: Relação sexual (principalmente). A mulher pode ser infectada tanto por parceiros do sexo masculino quanto do sexo feminino (por contato genital). O homem por parceiras do sexo feminino.
É importante considerar aqui que mesmo a pessoa portadora da doença, mas sem sintomas, pode transmitir a infecção.
Fômites.

Diagnóstico laboratorial:

• Microscopia direta a fresco com a utilização da técnica de coloração de Giemsa.
• Meio de cultura: Meio de Pavlova modificado.

Fontes de pesquisa:

- http://pt.wikipedia.org/wiki/Trichomonas_vaginalis

- http://www.dst.com.br/pag10.htm

Uso de Lactobacilos para a identificação de secreção vaginal

A biologia molecular tem se mostrado uma forte ferramenta nas análises microbiológicas para a identificação de microrganismos em investigação perito criminal.

Segundo FLEMING (2010), foi possível fazer a identificação dos lactobacilos Lactobacillus crispatus e Lactobacillus gasseri através de marcadores genéticos em regiões intergênicas 16S-23S do rRNA. Esses lactobacilos são encontrados apenas em secreções vaginais, sendo totalmente ausente em sêmen, sangue, suor e saliva. FLEMING op cit observa a presença dos lactobacilos apenas em sangue menstrual, devido sua origem.

A técnica utilizada foi à mesma utilizada em análise de DNA, reação de polimerase em cadeia (PCR). Os testes nas voluntárias mostraram a presença dos lactobacilos em mulheres com diferentes níveis de expressão de genes hormonais, onde sua prevalência ocorria em mulheres na pré e pós-menopausa, grávidas e histerectomia.

O presente trabalho revelou que os lactobacilos pesquisados se demonstraram um ótimo bioindicador para a identificação de secreção vaginal em cena de crimes de abuso sexual.

Referencia bibliográfica:

FLEMING, R.I; HARBOSON,S. The use of bactéria for the identification of vaginal secretion, Forensic Science International: Genetics 4 (2010) 311–315

Associando fungos do solo com covas e sanitários: Para uma micologia forense

Naohiko Sagara, Takashi Ymanaka and Mark Tibbett

O corpo humano pode ser dividido em tecidos moles e duros. As formas que compõe os músculos, órgãos internos, veias e sangue, e depois irão compor os ossos, cabelos, unhas. Onde um cadáver tiver sido deixado para a decomposição no terreno e não ter sido enterrado antes ou durante a decomposição, os tecidos moles podem facilmente desaparecer, consumido por invertebrados e bactérias, enquanto o tecido duro endurece.

A possibilidade dessa reação, pois os tecidos duros possuem um grupo de fungos adaptados a este substrato Queratinofilico fungi. Em contrate, os tecidos moles teriam apenas relativamente e recentemente mostrado por leveduras, que é um grupo particular de fungos após este desaparecimento. Igualmente, fezes, especialmente de herbívoro que suportará muito tempo é Coprophilous fungi que podem resistir, enquanto urina e fezes decompostas tem sido mostrado recentemente por leveduras. Esses dois grupos de fungos são espécies próximas, por possuir similaridades na composição e desenvolvimento. Este trabalho tem por objetivo focar os aspectos negligenciados e a sua importância forense.

A aplicação desta pesquisa na área de microbiologia forense está associada à tafonomia forense, que corresponde aos estudos dos processos de fossilização de animais e vegetal no solo.

O uso potencial de fungos na tafonomia forense originou-se de um estudo em fungos esporulentos ou experimentos com frutos no solo de florestas após a adição de uréia (ou compostos nitrogenados como a amônia).

Neste estudo encontraram condições em que alguns fungos após a decomposição do “Cadáver” e excrementos (tanto fezes como urina) e mudanças similares no solo para o tratamento com uréia ou amônia ao solo. Este processo mostra suficientemente para estabelecer o local do cadáver e dos excrementos decompostos como um novo habitat dos fungos, dando uma vantagem competitiva para um grupo especial de fungos. Porem, o tratamento do solo com uréia (ou outros compostos amoníacos) pode similar uma decomposição de um cadáver e excrementos, sendo uma das grandes perspectivas para a micologia forense. Este trabalho também discute a respostas dos fungos tratados com uréia como uma base fundamental para micologia forense.

Nesse trabalho os fungos que formaram corpos frutíferos no solo após tratamento com uréia são chamados de Ammonia fungi, e as que formaram corpos frutíferos após decomposição cadavérica e excrementos sobre condições naturais são chamadas de Post-putrfection fungi.

Sucessão Fungi:

A sucessão de fungos amoniacais visto pela seqüência reprodutiva em solos tratados com uréia:

DEUTEROMICETOS --- ASCOMUCETOS (maioria Discomicetos) --- BASIDIOMICETOS (maioria Agaricales)

Alternativamente, a sucessão pode ser dividida em primeira fase ou estágio e ultima fase ou estágio. A primeira fase (EP: EARLY PHASE) compreende em Deutoromicetos: Amblyosporium botrytis, Doratomices putredinis; Discomicetos: Ascobolus denudatus,Peziza moravecii; Agaricale: Lyophyllum tylicolor, Coprinus spp.

A ultima fase compreende em grandes e pequenos fungos como, por exemplo, Basidiomicetos: Hebeloma spp; Laccaria spp,Lyophyllum ambustum. As duas fases normalmente ocorrem descontinuamente, havendo uma interrupção entre 142 dias e 191 dias.

Fungo Pós-Putrefação (PPF) e fungos amoniacais (AF):

Crescimento de fungos em cadáveres em decomposição abandonados sobre o solo:

Cadáveres humanos e/ou animal abandonados sobre o solo se decompõe rápidamente. Por exemplo, nas estações quentes do Japão, em que temperaturas elevadas (acima de 25°C), um cadáver pode sofrer um decomposição significante em 10 dias, deixando principalmente ossos e cabelos. Imediatamente após este estágio de decomposição, próximo a esqueletização, ocorre uma fase zigomiceto: Mucor spp e/ou Rhopalomyces strangulatus nos restos mortais e em sua volta sobre o solo. Estes fungos não aparecem em solo tratado com uréia, portanto são classificados como fungos pós-putrefação (PPF) e não fungos amoniacais (AF). O aparecimento de R.strangulatus nos restos cadavéricos sobre o solo é acompanhado por um forte cheiro de carcaça apodrecida. A partir deste ponto, sucessão do fungo torna-se semelhante aos fungos que se desenvolvem em solos tratados com uréia, apresentando matriz semelhante as espécies frutíferas. Contudo, algumas espécies que não pertencem aos fungos amoniacais, como Scutellinia scutellata e Glamus pubescens, podem juntar-se a esta sucessão, como as observadas após o experimento realizado em campo. As mudanças do solo no local onde os cadáveres se decompuseram eram similar as tratadas com uréia. A mudança de cor para preto nos humos é freqüentemente misturada ao óleo ou gordura, mas devido ao fato da alcalinidade da amônia ou aminas.

Crescimento de fungos em cadáveres em decomposição enterrados:

A primeira fase da sucessão dos fungos amoniacais não é observada, a menos que o enterro tenha sido muito raso. Isto porque a primeira fase requer húmus como substrato e porque seu pseudorriza não se desenvolve, crescendo para fora do solo profundo. A cova rasa do cadáver de um mamífero, com uma cobertura de solo, por exemplo, menor que 10cm, daria origem a mais fungos amoniacais de ultima fase. Sobre uma cova funda, talvez maior que 20 cm, só estas espécies pode responder a recuperação, incluindo raízes de plantas em solos profundos e desenvolvimento de pseudorrizas, por exemplo, Hebeloma radicosoides ou H.danicum. Este fenômeno tem raízes na cultura popular e na America do norte, Hebeloma syrjense (que pode ser coespecífico com Hebeloma danicum, sendo conhecido como o identificador de cadáveres, onde parece não haver outros artigos sobre o desenvolvimento de fungos em corpos humanos enterrados. Embora não haja data na literatura em que esteja relacionada claramente com a biologia moderna.

Na vegetação não ectomirrizoides, a ultima fase é raramente observada, porque as espécies não ectomicorrizoides são raras entre os fungos de ultima fase. O tecido adiposo fica algum tempo no solo como adipocera, que possibilita auxiliar como barreira na ação de invertebrados e micróbios de solos profundos.

Crescimento de fungos sobre o solos com excrementos em decomposição:

A partir de alguns dados avaliados, é claro que excrementos humanos como fezes e urina produzem alguns fungos amoniacais, pois a sucessão fungica desenvolvidas nesse solo é parecida com as que se desenvolvem em solos tratados com uréia, embora o número de espécies encontradas em um local particular é baixo. Os guaxinins (Nyctereutes procyonoides) marcam latrinas na floresta ocupando uma área de 0,5m² ou menor. Aqui eles urinam e defecam repetidas vezes por vários anos. Tal local possibilita a produção de fungos amoniacais, mas usualmente carece de observar fungos de primeira fase em solos tratados com uréia para haver comparação entre ambos. Isto porque as excretas depositadas são repetidas. Em vez disso, alguns poucos fungos não amoniacais, por exemplo, Mucor spp e Ascobolus spp podem aparecer nas fezes delas mesmas.

A localização do local onde o excremento foi depositado e a identificação do animal que depositou o excremento são difíceis. Embora uma mudança de cor no solo, descrito anteriormente, pode ser notada. Devido estas dificuldades, muitos registros de fungos amoniacais de locais não experimentais teria sido ignorado, embora ele certamente indicasse a presença de excreção.

Desenvolvimento de fungos em solos com excrementos em decomposição enterrados:

Informações dos excrementos enterrados é disparate com alguns dados disponíveis sobre excrementos humanos enterrados, nos ninhos de vespas, nos dejetos de toupeiras, de musaranho e de dejetos de ratos do mato. Similarmente com cadáveres enterrados, estes locais são caracterizados pelo crescimento de raízes profundas de fungos ectorrizoides do gênero Hebeloma, onde também surgem na sucessão que pertence aos grupos de fungos de fase inicial (Primeira fase) de fungos amoniacais. A principal fonte de amônia, no caso de ninhos de vespas e a presença de ácido úrico contidas nas pelotas fecais excretadas pelas larvas das vespas.

Hebeloma radicosum – desenvolvem-se exclusivamente nos dejetos de topeiras (Talpidae), dejetos de musaranho (Talpidae) e nos dejetos dos ratos do mato (Muridae: Apodemus) sobre o solo é um fungo não-amoniacal. Esses fungos nunca seriam encontrados em outros substratos ou após alguns experimentos em solos tratados, pois esta reação seria mais uma proposta para uso do termo fungos pós-putrefação (PPF).

Possibilidade para a aplicação forense:

Foto 1: Hebeloma spp Foto 2: Laccaria bicolor

Ação humana ou atividades em que pode ser evidencias para o crescimento de fungos:
Exemplos de crescimentos de fungos descritos anteriormente têm mostrado que, cadáveres animais abandonados ou enterrados, pontos onde houve depósito de urina e/ou fezes pode ser detectado pela ocorrência de estruturas reprodutivas de alguns fungos específicos. Outro excelente exemplo é dado quando interpretações consideráveis de atividade humanas em que pode ser feita pela evidencias micológicas. Existem locais, onde não se é perceptível a presença de vestígios de excrementos recentes. A presença de resíduos de papeis por trás de moitas da vegetação pode ser sugestiva na ação humana em atos de urinação e defecação naquele local. A ocorrência de dois tipos de fungos amoniacais (AF) Hebeloma danicum e Laccaria bicolor confirmam a ação humana ou presença de cadáveres no local.
- Condições iniciais e a associação com o intervalo pós-deposição:
As observações nas sucessões e outras produções in situ podem uma avaliação aproximada do tempo onde o cadáver foi abandonado (IPM- Intervalo pós-morte), ou no depósito de excrementos nos dados locais. Uns exemplos realizados em trabalhos de campo com carcaça de gato observou-se o desenvolvimento de Laccaria bicolor no mês de maio-junho (início do verão), parecendo ser a primeira “Floração” da fase final na sucessão dos fungos amoniacais. Estes detalhes ajudaram estabelecer que o corpo do gato não tivesse sido enterrado por muito tempo.

Limitações

Normalmente, alguma espécie de fungos relatada neste trabalho não indicaria necessariamente a presença de cadáveres ou excrementos animais nos locais onde se desenvolveram.
A maior barreira para a aplicação forense encontra-se em sua investigação, pois:
1. É difícil a sua detecção em campo, desde suas estruturas reprodutivas por serem muitas vezes efêmeras. Quando se deseja encontrar fungos em campo, o perito poderá observar especificamente sua incidência. A não ser que estudos específicos sejam feitos, pois na investigação é possível que se passe por despercebido estruturas reprodutiva dos fungos.
2. É dificultosa a reconhecer espécies e identificá-las, devido sua forma e tamanho, além de novas espécies ou espécies não catalogadas (não descobertas).
A aplicação da micologia forense tem se tornado uma potente ferramenta judicial em que foi reavivada, sendo um dos maiores desenvolvimentos no campo da pericia criminal nos últimos 20 anos.
Desejamos que microbiologistas e peritos colaborassem no desenvolvimento deste estudo como uma potente ferramenta para a micologia forense.

Referencia Bibliográfica:
Sagara N., Yamanaka T., Tibbett M. – SOIL ANALYSIS IN FORENSIC TAPHONOMY – Chemical and Biological Effects of Buried Human Remains, CRC Press Group New York –USA, 2008: Soil associated with graves and latrines: toward a forensic mycology, capitulo 4.
p.64 – 107.

Investigação de Vínculo Genético: Aplicação do DNA em testes de Paternidade

PÚBLICO ALVO
Biomédicos, Biólogos, Farmacêuticos, Médicos, Advogados, Juristas e outros profissionais da área da saúde, estudantes de graduação e pós-graduação que desejam atualizar-se sobre o assunto.


PROGRAMAÇÃO
• Princípios básicos da investigação de vínculo genético
Hereditariedade
Histórico: como tudo começou e o que mudou em um século
O DNA como ferramenta para análise de paternidade (uso de STRs)
• Teste de Paternidade por DNA: passo a passo
Coleta
Extração
Amplificação
Detecção
Interpretação e cálculo
• Estudo de casos
Trios (mãe, criança e suposto pai)
Duos (criança e suposto pai)
Identificação de indivíduos (pessoas desaparecidas, desastres em massa)
Paternidade post-mortem (suposto pai falecido)
Troca de bebês
• Marcadores uniparentais usados na investigação de paternidade/maternidade
Cromossomo Y
DNA mitocondrial


PALESTRANTE
MSc. Bruna de Paula Fonseca e Fonseca
Bióloga, especializada em Biologia Molecular, Perita em Testes de Paternidade desde 2007, com larga experiência em identificação humana. Formada pela Universidade Federal do Rio de Janeiro, possui pós-graduação em Biologia Forense e mestrado em Ciências Biológicas (Biofísica). Atuou como Gerente Técnica e Responsável pelo setor de Paternidade do Laboratório Centro de Genomas, em São Paulo, realizando cerca de 2000 exames de investigação de paternidade por ano além de coordenar as investigações de paternidade post-mortem realizadas para o Instituto de Medicina Social e de Criminologia de São Paulo (IMESC).

LOCAL

Largo de São Francisco de Paula, Nº 34 – 5º andar - Centro - Rio de Janeiro – RJ


DATA E HORÁRIO
Dias 16 de outubro de 2010 - sábado Carga horária: 8 horas
8h às 17h


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PROGRAMAÇÃO
08:00h – Credenciamento;
08:30h – Início do Curso;
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10:45h – Retorno as atividades;
12:30h – Intervalo (almoço);
13:30h – Retorno das atividades;
16:00h – Café com prosa;
16:15h – Retorno as atividades;
18:00h – Encerramento e entrega de Certificados.


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Identificação de Neisseria gonorrhoeae por Biologia Molecular em peça de roupa de um acusado de crime sexual contra uma criança no Reino Unido.

Quando adquirimos um resfriado de um parente ou amigo, não temos como provar cientificamente que a doença foi transmitidas por eles, pois o vírus responsável pelo resfriado é adquirido pelo ar em partículas de aerossol. Mas quando a é uma doença de transmissão interpessoal, como é o caso das DSTs – Doenças Sexualmente transmissíveis?
Martin et al. (2007) relataram um caso em que utilizaram técnicas de biologia molecular para identificação da bactéria Neisseria gonorrhoeae como evidencia de crime de abuso sexual contra uma criança no Reino Unido, ligando a bactéria encontrada nas roupas intimas do acusado ao material biológico coletado da vitima.
A bactéria Neisseria gonorrhoeae é o principal agente etiológico da gonorréia, patologia ocasionada exclusivamente por contato sexual. Sua identificação em laboratórios para fins clínicos é comum, nunca foi utilizado para fins legais (ISON, 2006).
As N.gonorrhoeae são diplococos (cocos aos pares) Gram negativas e são isoladas através de meio de cultura especifico Thayer Martin encubado em estufa bacteriológica à 37ºC.
ISON, 2006 et al utilizaram as técnicas de cultivo para N.gonorrhoeae para comparar a cepa bacteriana com a cepa encontrada na criança, vitima do abuso sexual.
Os pesquisadores utilizaram o meio de cultura GC (OXOID) suplementado com Vitox® à 1% e encubado em estufa bacteriológica à 36ºC em ambiente com 5% de dióxido de carbono, além de testes bioquímicos confirmatórios da oxidase e outro teste imunológico.
Utilizaram técnica de extração de DNA da cepa coletada para sua amplificação pela técnica de PCR (Ração de Polimerase em Cadeia), utilizando dois marcadores genéticos ompIII e cppB e incluindo um cepa controle positiva e negativa para cada PCR.
O método definitivo para a comparação das cepas da cultura coletada da vitima e a amostra pesquisada na cueca do acusado foi realizada pelo NG-MAST seqüenciador de DNA especifico para N.gonorrhoeae, onde foi utilizaram outros marcadores por e tbpB. O resultado mostrou-se positivo para o marcador tbpB, o que segundo ISON, 2006 foi suficiente para o acusado ser condenado por abuse sexual em criança e reconhecido como uma excelente ferramenta para a utilização em fins legais.

Referência:
- Gunn, Alan.
Essential forensic biology / Alan Gunn. – 2nd ed. 2009
- Ison, C. et al. Non-cultural detection and molecular genotyping
of Neisseria gonorrhoeae from a piece of clothing - ournal of Medical Microbiology (2007), 56, 487–490

IDENTIFICAÇÃO HUMANA EM CASO FORENSE POR MEIO DA ANÁLISE DE MICROBIOTA CUTÂNEA

Autores: Noah Fierer, ,Christian L. Lauber, ,Nick Zhou, Daniel McDonald, Elizabeth K. Costello e Rob Knight
PNAS | April6,2010 | vol.107 | no.14 | 6477–6481
Colaboração do resumo tradusido por: Eduardo Rodrigues Ms. Do Departamento de Genética e Evolução da Universidade Federal de São Carlos UFSCA.

A superfície da pele humana abriga uma ampla gama de bactérias e que podem ser transferidas para outras superfícies uma vez que estas sejam tocadas, além disso, tal comunidade bacteriana pode sobreviver por um longo período de tempo sobre diversas superfícies, isto porque muitas sobrevivem a temperaturas e pressões elevadas, pH extremos, incidência de radiação ultravioleta e outros estresses ambientais.
Estudos recentes tem demonstrado que há um grau de compartilhamento de microbiota pouco considerável entre dois indivíduos (Fierer et al., 2008), e um nível de diferenciação individual é observado em outros pontos da pele humana. (Grice et al., 2009; Costello et al., 2009). Além do mais, as comunidades bacterianas são relativamente estáveis ao longo do tempo, por exemplo: algumas horas depois de lavar as mãos é possível recuperar a microbiota associada (Fierer et al., 2008), e em média, a variação interpessoal da microbiota supera a variação intraindividual.
Considerando que os indivíduos podem abrigar uma microbiota associada a pele única, temporalmente estável e transferível, os autores sugerem que seja possível, usando as bactérias, identificar um indivíduo que tenha tocado algum objeto, como por exemplo, um teclado ou “mouse” de computador.
Assim sendo, para demonstrar a aplicabilidade da hipótese dos autores, algumas premissas devem ser seguidas: (i) O DNA bacteriano oriundo de uma superfície tocada por uma pessoa deve permitir uma caracterização e comparação adequada da microbiota; (ii) as comunidades bacterianas devem se manter estáveis nas superfícies por dias ou até semanas; e (iii) as superfícies que forem tocadas podem ser efetivamente associadas a indivíduos por meio da avaliação do grau de similaridade entre a comunidade bacteriana sobre o objeto e do indivíduo que a tocou.
Dessa forma, os autores executaram três estudos correlacionados que combinam técnicas recentes na análise filogenética de comunidades (Lozupone & Knight, 2005) e metodologia de pirosequenciamento (Hamady et al., 2008). Primeiro foi comparado a comunidade bacteriana encontrada em teclados e mouse de computador indivíduos e nos dedos dos proprietários destes. Segundo, foi a similaridade das comunidades sobre objetos, estocadas a –20ºC (método padrão de armazenamento de amostras antes da extração de DNA) em relação aos objetos sob temperatura ambiente por 14 dias. Finalmente, os objetos foram associados aos indivíduos pela comparação da comunidade bacteriana sobre os teclados e mouse de computador contra um banco de dados contendo informações sobre a microbiota associada à pele para mais de 250 indivíduos, incluindo os proprietários.
Os autores, para avaliarem os critérios i e iii, recolheram amostras de três computadores e compararam as comunidades bacterianas sobre as pontas dos dedos dos proprietários. Outros computadores públicos e pessoais foram amostrados de modo a avaliar o grau de correspondência entre as comunidades bacterianas dos dedos dos proprietários em relação a computadores nunca tocados por eles. Após as coletas, o DNA bacteriano foi extraído de “swabs”, e a composição bacteriana foi determinada pela abundância de seqüências de nucleotídeos referentes ao gene 16S (localizado no genoma mitocondrial), sendo obtidos 1400 sequências distintas por amostra. Os autores puderam constatar que a comunidade bacteriana nas pontas dos dedos dos proprietários dos computadores e de seus respectivos computadores eram muito similares entre si do que em comparação aos de outros indivíduos. Estes resultados demonstram que o DNA bacteriano pode ser recuperado de superfícies relativamente pequenas, que a composição das comunidades associadas aos computadores são distintas entre os três teclados, e que os indivíduos transferiram uma composição única sobre o seus teclados.
Outras amostras foram retiradas do teclados dos computadores, com o auxílio de um “swab”, a fim demonstrar a estabilidade temporal das comunidades bacterianas associadas a pele sobre outras superfícies. Desta forma, um estudo em pequena escala foi conduzido a fim de avaliar se as comunidades bacterianas sofrem alterações na composição após exposição a condições ambientais típicas. Igualmente, amostras da superfície da pele de indivíduos foram retiradas e armazenadas a –20ºC e outras armazenadas em temperatura ambiente (≈20°C) por cerca de 15 dias. Os resultados mostraram que as condições ambientais típicas afetaram a composição de maneira não considerável ou a capacidade de resolver diferenças entre a composição bacteriana sobre a pele de dois indivíduos, em até duas semanas.
Estes resultados demonstraram um grande potencial na aplicação na identificação de indivíduos em casos forense, dando condições de associar a bactéria em um objeto a um possível suspeito que tenha contato com aquele objeto e mantendo as mesmas características genotípicas da bactéria da flora que compõe a mão do mesmo individuo.
Os resultados indicaram que a metodologia apresentada possui uma aplicação potencial nas ciências forenses, de modo a possibilitar conexão entre um objeto e seu usuário. Portanto, outro experimento mais objetivo foi planejado, de maneira a determinar a eficácia da metodologia para identificação forense. Os autores objetivavam verificar se a composição bacteriana sobre um objeto pessoal eram mais similares a bactérias encontradas sobre a pele do proprietário do que em comparação com outros indivíduos da população, ou seja, uma análise similar ao cálculo de Probabilidade de Coincidência ao Acaso (RMP, do inglês Random Matching Probability), executada em laudo genéticos. Assim, foram amostradas bactérias de nove “mouses” computadores que não tinham sido tocados por mais do que 12 mãos a partir da mão da mão proprietário. Em todos os nove casos, a comunidade bacteriana sobre cada “mouse” foi significativamente mais similar a comunidade presente na mão do proprietário do que em relação as outras mãos presentes no banco de dados, indiicando o potencial da técnica para identificação humana.
No entanto, como em outras técnicas com aplicações forenses, o estudo requer testes mais consideráveis e refinamentos a fim de testar a precisão da técnica em comparação com outras técnicas padrões já validadas. Os autores ainda citam que será importante avaliar como a precisão da técnica pode ser aprimorada pela compilação de um amplo banco de dados de comunidades bacterianas associadas a pele, obtendo mais seqüências por amostra, realizando coletas múltiplas por objetos ou mãos, desenvolvendo novos métodos de análise de similaridade das composições bacterianas, entre outras análises. Além de ser testada a funcionalidade da metodologia em superfícies de materiais diferentes, objetos pouco tocados freqüentemente, ou objetos que tenham estado em contato com múltiplos locais do corpo de uma dada pessoa.


Referências:
Fierer N, Hamady M, Lauber C L, Knight R (2008) The influence of sex, handedness, and washing on the diversity of hand surface bacteria. Proc Natl Acad Sci USA 105: 17994–17999.
Grice E A, et al. NISC Comparative Sequencing Program (2009) Topographical and temporal diversity of the human skin microbiome. Science 324:1190–1192.
Costello E K, et al. (2009) Bacterial community variation in human body habitats across Space and time. Science 326:1694–1697.
Lozupone C, Knight R (2005) UniFrac: A new phylogenetic method for comparing Microbial communities. Appl Environ Microbiol 71:8228–8235.
Hamady M, Walker J, Harris J, Gold N, Knight R (2008) Error-correcting barcoded Primers allow hundreds of samples to be pyrosequenced in multiplex. Nat Methods 5: 235–237.

Microbiologia Forense: Uma breve história

Fonte: http://www.microbelibrary.org/microbelibrary/files/ccImages/Articleimages/cdcphil/Yersinia%20pestis%20fig6.jpg
Foto 2: Microscopia de uma lâmina com cepa de Yersinia pestis

http://img181.imageshack.us/i/02sp6ta6.jpg/
Foto 1: Claviceps purpurea (Fungo patogênico onde se extraiam suas micotoxinas).

O uso de agentes patogênicos como arma biológica não é nenhuma novidade, pois o mesmo tem sido documentado por muitos anos.
Os antigos Romanos contaminavam os poços de água de seus inimigos com carne apodrecida, em que são ricos em bactérias patogênicas.
Durante o século 14, a cidade de Kaffe (atualmente Feodosiya Ukrânia) foi cercada e atacada por soldados Tarta da Mongólia, espalhando a “Peste negra” (Doença Bubônica – Bactéria Pasteurellas pestis (atualmente Yersinia pestis). Os soldados Tartas catapultavam os corpos dos soldados mortos por doença bubônica como arma biológica para a cidade de Kaffa, contribuindo assim com a epidemia de “Peste bubônica” na Europa na idade média.
Conquistadores espanhóis e britânicos utilizaram cobertores e roupas contaminadas com o vírus da varíola e sarampo contra os Nativos Americanos. Segundo a história essa mesma tática teria influenciado os franceses contras os índios.
Durante a segunda guerra mundial os japoneses utilizaram pulgas criadas em laboratório que se alimentavam de ratos contaminados. Os japoneses utilizaram as pulgas como armas biológicas sendo lançadas sobre a China de seus aviões.
O grupo religioso (conhecidos por fazer ataques no metrô de Tókio com gás sarim que ataca o sistema nervoso humano e mata) teria tentado espalhar material contaminado de Bacillus anthrax do alto de um prédio histórico de Tókio onde eram realizados seus cultos. O ataque não causou nenhuma doença, pois a população tinha sido vacinada. Acredita-se então que o mesmo grupo tenha usado a toxina botulínica e cogumelo venenoso, porem seus ataques não obteve sucesso.
Em 1984 seguidores do grupo religioso Baghwan Sri Rajneesh tentou influenciar nos resultados das eleições locais em Dallas, Oregon USA. O grupo teria contaminado a salda de 10 restaurantes com a bactéria Salmonella typhimurium, onde 751 pessoas desenvolveram intoxicação alimentar.
Em 1996 no Texas, Dallas – USA foi documentado a ocorrência de 20 técnicos de laboratório que foram infectados intencionalmente por Shigella dysenteriea tipo 2. Os técnicos apresentaram sintomas de diarréia. Foi feito uma investigação para fazer a triagem do microorganismo que causou a contaminação. Segundo as investigações, os técnicos desenvolveram os sintomas após consumirem bolos do tipo Muffin (semelhante ao Ana Maria aqui no Brasil) no café da manhã do laboratório. Foram coletadas amostras biológicas de fezes para análise microbiológica para serem comparadas com os resultados das analises dos “bolinhos” Muffin contaminados. O resultado foi confirmado por meio de analise microbiológico e técnica de PCR (reação em cadeia de polimerase) comparando o DNA das bactérias analisada. A investigação encontrou uma técnica do próprio laboratório como a responsável do crime, pois a mesma já havia cometido mais 5 crimes e falsificação de documentos do laboratório.
Historicamente ocorriam muitos ataques contra animais de criação como cavalos. Por exemplo, na primeira guerra mundial, a bactéria Burkholderia mallei foi utilizadas por soldados alemães para infectar cavalos e mulas dos seus inimigos. Na verdade foi estabelecido um laboratório em Chevy Chase, Maryland em 1916 para cultivo de Burkholderia mallei e outros microorganismos vivos para infectar animais do exercito americano. Os russos utilizaram o mesmo microorganismo nos anos 80 na guerra do Afeganistão.
As bactérias e suas toxinas não eram as únicas a serem usadas como arma biológica. Houve também a utilização de micotoxina (toxina dos fungos) para causar graves doenças e até a morte. No século VI depois de Cristo, os Sírios tomaram o conhecimento do potencial das micotoxinas como arma biológica, onde eles envenenavam seus inimigos através de água contaminada por Claviceps purpúrea, fungo parasita que muito rico em alcalóides, substância altamente tóxica ao homem. Logo após a Segunda Guerra mundial, soldados Russos utilizaram a micotoxina de um fungo do gênero Fusarium spp. em farinha de trigo contaminadas em que eram feito os pães e distribuídos para a população se alimentarem, mas logo sofreram de graves doenças.
As micotoxinas foram espalhadas em Laos (pais asiático) por pulverização em 1975 – 1981, no Camboja em 1979 – 1981 e no Afeganistão de 1979 a 1981. Mais de 10.000 pessoas entre civis e soldados morreram envenenadas por micotoxinas. O Iraque teria desenvolvido um programa para a utilização de Aflatoxina como arma biológica.

Microbiologia Forense: conceitos

A microbiologia forense é a aplicação dos estudos de microorganismos em investigações de provas legais em área de suspeita de crime (SAFERSTEIN, 1995).
Microbiologia forense é um campo relativamente novo que pode ajudar na resolução dos casos, tais como:
• Ataque de Bioterrorismo: É a utilização de microorganismos, tais como, bactérias ou vírus como arma biológica. Um exemplo foi o uso do Bacillus anthrax como arma biológica utilizadas por terroristas (BREEZE, 2005).
• Negligência médica: Muitos casos foram denunciados por jornais e noticiários de TV contaminações por “super bactérias” em enfermarias de hospitais ocasionando diversos óbitos de pacientes. Ocorre quando médicos e/ou enfermeiros manipulam pacientes com imunidade baixa, infectando-os por bactérias oportunistas, além de materiais contaminados para tratamento dos pacientes.
• Surtos de doenças por alimentares contaminados: A falha no processo de descontaminação e conservação dos alimentos pode ocasionar o crescimento de microrganismos patogenos, como por exemplo, Salmonella typhi, Yersinia enterocolitica, Shigella desinteries, dentre outras bactérias, ocorrendo o crime de atentado à saúde pública (SALYERS, 2003).
• Crimes sexuais: É um tipo de crime em que a vitima é acometida de violência, onde a posse sexual, em que o agressor poderá infectá-la por bactérias e vírus sexualmente transmissíveis como a sífilis, AIDS e gonorréia.

Fontes Bibliográficas:
- BREEZE, R.G., BUDOWLE, B., WILSON, M.R., BURANS, J.P., CHAKRABORTY, R. Microbial Forensic, 1ª Edition. New York: Academic Press, 2005 Cap.1 p. 1-17.

- SAFARSTAIN, R. (Edit) Criminalistics – An introduction to Forensic Science, fifth edition. New Jersey: Pratice Hall Education, 1995.

- SALYER, A. A. Microbes in Court: The emerging Field of microbial forensic. (2003) Disponível na URL: