Pesquisa de fungos filamentosos a partir de Cannabis sativa L. (Maconha) em uma pericia criminal

A Cannabis sativa L. é uma planta produtoras de substâncias psicoativas, classificada como planta proscrita por conter essa propriedade. Ela é conhecida popularmente com maconha ou marijuana.

Em planta herbaceae constituída de flores femininas maturas e compostas por folhas pistiladas. A forma resinosa, conhecida como haxixe, consiste fundamentalmente de tricomas glandulares coletados do mesmo material vegetal.

O principal composto químico psicoativo presente na cânabis é o Δ9-tetrahidrocanabinol (delta-9-tetrahidrocanabinol), comumente conhecido como THC - cuja concentração média é de até 8%, mas algumas variedades de maconha (cruzamentos entre a espécie Cannabis sativa e a Cannabis indica) comumente conhecidas como skunk ("cangambá", em inglês) produzem recordes na marca de 33% de THC. Pelo menos 66 outros canabinóides estão presentes na Cannabis, como ocanabidiol (CBD) e o canabinol (CBN), muitos dos quais causam interações psicoativas.

Fungos filamentosos são conhecidos também como bolores em que constituem vários gêneros como Aspergillus spp., Penicillium spp., Scopulariopsis spp., Chysosporium spp.

A maioria dos fungos desenvolve-se como hifas, que são estruturas filamentosas, cilíndricas, com 2 a 10 µm de diâmetro e até vários centímetros de comprimento. As hifas crescem nas suas extremidades (ápices); novas hifas formam-se tipicamente por meio da emergência de novas extremidades ao longo da hifa existente num processo designado “ramificação”, ou ocasionalmente por bifurcação de extremidades de uma hifa em crescimento, dando origem a duas hifas com crescimento paralelo. A combinação do crescimento apical com a ramificação/bifurcação conduz ao desenvolvimento de um micélio, uma rede interconectada de hifas. As hifas podem ser septadas ou cenocíticas: as hifas septadas são divididas em compartimentos separados por paredes transversais (paredes celulares internas, chamadas septos, que se formam perpendicularmente à parede celular, dando à hifa a sua forma), cada compartimento contendo um ou mais núcleos; as hifas cenocíticas não são compartimentadas.

CAZENAVE, 2003 faz o levantamento de fungos filamentosos em prensados de Cannabis sativa L. (Maconha), realizado no Instituto Médico Legal de Campinas-SP. Seu trabalho constitui de uma importância tanto epidemiológica como para perícia forense. O trabalho busca orientar os profissionais que estão em contato com a planta durante sua apreensão e identificação, assim como os seus usuários, pois ambos os tipos de exposições podem levá-los manifestações de sintomas que vão de alergias a intoxicação devido aos esporos e hinfa dos fungos.

Os fungos mais freqüentes identificados em sua pesquisa foram: Aspergillus sp, Fusarium sp, Penicillium sp, Cephalosporium sp e Cladosporium sp.

A técnica de cultivo foi realizada com utilização de meio de cultura Agar Saboraud Dextrose em placa de Petri 90 x15 com 20 ml e 5 ml em tubos 10 x 15 inclinado para a sua manutenção das cepas e nova análise, o mesmo processo de manutenção também corresponde a Cadeia de Custódia, onde as provas de um delito são guardadas sob responsabilidade da Secretaria de Secretaria de Segurança Pública em quanto corre o processo judicial.

As colônias foram isoladas e identificadas com técnicas tradicionais em microbiologia e micologia tanto microscópica como macroscópica.

Fonte de pesquisa:

CAZENAVE, S.O.S., Isolamento e identificação de fungos filamentosos a

partir de “Cannabis Sativa l.”. Revista de Toxicologia em Línea nº 03 p. 01 - 12 dezembro 2003.

http://www.anvisa.gov.br/legis/portarias/344_98.htm

http://pt.wikipedia.org/wiki/Maconha

http://pt.wikipedia.org/wiki/Fungi#Morfologia

Isolamento de Escherichia coli O157:H7 em pericia de alimentos processados derivados de carne animal.

Colônias de Escherichia coli enter-hemorragica em agar McConkey com Sorbitol (Fonte de pesquisa:http://madscientistjunior.blogspot.com/2009_03_01_archive.html)

“Kim Reggis, conceituado cirurgião cardíaco dos USA, leva sua filha adolescente Becky Reggis para jantar fora em uma lanchonete badalada da sua região, a Onion Ring. Após terem comido um hambúrguer malpassado, sem saber que naquele hambúrguer se encontrava uma das formas mais patogênica da espécie bacteriana Escherichia coli O157:H7, produtora de uma toxina mortal.

A pequena Becky passou a sentir dores abdominais no dia seguinte e cada dia que passava se agravava mais os sintomas de mal estar. Incapaz de impedir a progressão da doença, ele se lança em uma investigação solitária para descobrir como e por que sua filha ficou doente. “A trilha de pistas leva às grandes industriais de carne e suas práticas assustadoras.” Livro: TOXINA – Robin Cook, editora Record Rio de janeiro, 1999.

A Escherichia coli é uma enterobactéria Gram-negativa comum no intestino animal. Cerca de 200 E.coli patogênicas conhecidas podem causar doenças diarréicas e infecções do trato urinário, que representam risco de vida. Linhagens de E.coli entero-hemorrágica (EHEC) produzem verotoxina, uma enterotoxina semelhante ao da bactéria Salmonella dysenteriae, a toxina Shiga. Após a ingestão de alimentos ou água contaminada com uma linhagem específica de EHEC, Escherichia coli O157:H7, o microrganismo se desenvolve no intestino delgado, onde produz a Verotoxina. Tal toxina provoca diarréia hemorrágica e insuficiência renal em crianças. A cauda mais comum dessa infecção corresponde ao consumo de carne crua ou mal cozida contaminada, principalmente carne moída processada em massa. Uma das principais formas de contaminação dessas carnes é na hora do abate no matadouro, em que o material intestinal entra em contato com a carne.

Já foram vários trabalhos científicos referente a pesquisa de E.coli O157:H7 em alimentos a base de carne moída processada para o consumo da população, principalmente adolescentes e crianças.

Uma das ferramentas utilizadas em laboratório para o cultivo deste patógeno é o meio de cultura McConkey com Sorbitol. Seu isolamento corresponde em semear o material questionado em Agar McConkey com sorbitol, incubar em estufa bacteriológica por 18 a 24 horas em atmosfera de CO₂. Seu resultado é interpretado pela presença de colônias rosa para vermelho, em que representa bactérias sorbitol positivo, pois a Escherichia coli entero-hemorrágicas são bactérias fermentadoras de sorbitol. É utilizado também o meio de cultura McConkey com Sorbitol suplementado com antibióticos, tais como cefixima, suplementado com cefixima e telurito. Outro método para a identificação laboratorial de cepas de Escherichia coli O157:H7 é a utilização da prova para a detecção do sorotipo O157 ou toxina tipo SHIGA diretamente nos materiais questionados.

Segundo TAVARES, 2006 pesquisou sobre os aspectos microbiológicos das carnes de Hambúrgueres prontas para o consumo, onde a característica comum da microbiota da carne bovina em condições higiênicas é composta por bacilos Gram-negativos como as da família das Enterobacteriaceae e do gênero Pseudomonas e por Gram-positiva dos gêneros Enterococcus, Lactobacillus e Staphylococcus. As bactérias patogênicas mais comuns encontradas nestes alimentos são Escherichia coli, Clostridium perfrigens, Staphylococcus aureus e Salmonellas spp. e ocasionalmente Yersinia enterocolitica, Clostridium butolinum e Bacillus cereus. A Escherichia coli O157:H7 é isolada com mais freqüência em hambúrgueres contaminados implicados em surtos infecciosos de origem alimentar.

A população atual devido ao pouco tempo disponível para a preparação de alimentos saudáveis, tem se apegado a alimentos industrializados para consumo rápido e barato como os hambúrgueres de carne bovina, tornou opção freqüente entre a população, principalmente jovens que freqüentam lanchonetes, Traillers de praça e lotre públicos, assim como redes fast food.

Segundo a Legislação do Código Penal Brasileiro Lei 9.677/1998:

ART.: 272 Corromper, adulterar, falsificar ou alterar substância ou produto alimentício destinado a consumo, tornando-o nocivo à saúde ou reduzindo-lhe o valor nutritivo:"(NR).

Referências Bibliográficas:

COOK,R - TOXINA- Editora Record Rio de Janeiro, 1999.

KONEMAM,E – DIAGNÓSTICO EM MICROBIOLOGIA: ATLAS E TEXTO 5ª Ed. Editora Medsi, Rio de janeiro, 2001. P.205 e 206.

TAVARES, T, M – CARNES DE HAMBURGUERES PRONTAS PARA CONSUMO: ASPECTOS LEGAIS E RISCO BACTERIANO. Revista Patologia Tropical Nº 35(1): 1-25. jan.-abr. 2006.

Site pesquisado: http://www.planalto.gov.br/ccivil/leis/L9677.htm

Trichomonas Vaginalis: Parasita de importância forense indicadora de crime sexual

A genética forense tem se mostrado uma forte ferramenta para a identificação de suspeitos de crimes sexuais, principalmente quando há o óbito da vítima, onde serão coletados vestígios deixado pelo mesmo na vítima. Mas quando a vítima sofre apenas o abuso pelo agressor? Quando a vítima por distúrbio nervoso toma algumas atitudes, em que possa eliminar alguns vestígios do criminoso em seu corpo, como um banho?

A microbiologia forense pode complementado essa lacuna, mostrando que se pode enriquecer uma investigação de crimes sexuais com pesquisas de bactérias, fungos e parasitas encontradas os orgãos genitourinário, tanto da vítima, quanto do agressor.

Dentre estes microorganismo a Trichomonas vaginalis pode se tornar um bom bioindicador desse tipo de delito.

O Trichomonas vaginalis é um parasita eucariota flagelado anaérobio facultativo com cerca de 15 micrômetros. Tem 4 flagelos desiguais e uma membrana ondulante que lhe dão mobilidade, e uma protuberância em estilete denominada axóstilo --- uma estrutura rígida, formada por microtúbulos, que se projeta através do seu centro até sua extremidade posterior. Não possui mitocôndrias, mas apresenta grânulos densos (hidrogenossomos) que podem ser vistos à microscopia óptica. Essas estruturas são portadoras da enzima piruvato:ferredoxina oxirredutase, a qual transforma piruvato em acetato por oxidação fermentativa, liberando energia na forma de ATP. O T. vaginalis é o agente causador da tricomoníase. Existe em apenas uma única forma (trofozoíto), que é simultaneamente infecciosa e ativa. Contudo formas arredondadas com flagelos internalizados muito semelhantes a cistos, porém sem apresentar parede cística são comumente encontradas. Estas formas são conhecidas como pseudocistos. Ao contrário do que se imaginavam os pseudocistos não são formas degenerativas, mas sim formas funcionais e metabolicamente ativas. Reproduz-se por pleuromitose fechada com fuso extranuclear. Cresce em pH entre 5,0 e 7,5 a temperaturas variando de 20 a 40 °C. Utiliza a glicose, a maltose e a galactose como fontes de energia. Mantém o glicogênio como forma de armazenamento de energia. Em condições adversas, podem utilizar também os aminoácidos, especialmente a arginina, treonina e leucina, como fontes energéticas.

Doença infecto-contagiosa do sistema gênito-urinário do homem e da mulher. No homem causa uma uretrite de manifestações em geral discretas (ardor e/ou prurido uretral e secreção brancacenta, amarelada ou amarelo esverdeada), podendo, eventualmente ser ausentes em alguns e muito intensas em outros.
É uma das principais causas de vaginite, vulvovaginite e cervicite (infecção do colo do útero) da mulher adulta podendo porém, cursar com pouca ou nenhuma manifestação clínica. Quando presente, manifesta-se na mulher como um corrimento vaginal amarelo esverdeado ou acinzentado, espumoso e com forte odor característico. Não é incomum também ocorrer irritação na região genital bem como sintomas miccionais que podem simular uma cistite (dor ao urinar e micções frequentes).
Transmissão: Relação sexual (principalmente). A mulher pode ser infectada tanto por parceiros do sexo masculino quanto do sexo feminino (por contato genital). O homem por parceiras do sexo feminino.
É importante considerar aqui que mesmo a pessoa portadora da doença, mas sem sintomas, pode transmitir a infecção.
Fômites.

Diagnóstico laboratorial:

• Microscopia direta a fresco com a utilização da técnica de coloração de Giemsa.
• Meio de cultura: Meio de Pavlova modificado.

Fontes de pesquisa:

- http://pt.wikipedia.org/wiki/Trichomonas_vaginalis

- http://www.dst.com.br/pag10.htm

Uso de Lactobacilos para a identificação de secreção vaginal

A biologia molecular tem se mostrado uma forte ferramenta nas análises microbiológicas para a identificação de microrganismos em investigação perito criminal.

Segundo FLEMING (2010), foi possível fazer a identificação dos lactobacilos Lactobacillus crispatus e Lactobacillus gasseri através de marcadores genéticos em regiões intergênicas 16S-23S do rRNA. Esses lactobacilos são encontrados apenas em secreções vaginais, sendo totalmente ausente em sêmen, sangue, suor e saliva. FLEMING op cit observa a presença dos lactobacilos apenas em sangue menstrual, devido sua origem.

A técnica utilizada foi à mesma utilizada em análise de DNA, reação de polimerase em cadeia (PCR). Os testes nas voluntárias mostraram a presença dos lactobacilos em mulheres com diferentes níveis de expressão de genes hormonais, onde sua prevalência ocorria em mulheres na pré e pós-menopausa, grávidas e histerectomia.

O presente trabalho revelou que os lactobacilos pesquisados se demonstraram um ótimo bioindicador para a identificação de secreção vaginal em cena de crimes de abuso sexual.

Referencia bibliográfica:

FLEMING, R.I; HARBOSON,S. The use of bactéria for the identification of vaginal secretion, Forensic Science International: Genetics 4 (2010) 311–315

Associando fungos do solo com covas e sanitários: Para uma micologia forense

Naohiko Sagara, Takashi Ymanaka and Mark Tibbett

O corpo humano pode ser dividido em tecidos moles e duros. As formas que compõe os músculos, órgãos internos, veias e sangue, e depois irão compor os ossos, cabelos, unhas. Onde um cadáver tiver sido deixado para a decomposição no terreno e não ter sido enterrado antes ou durante a decomposição, os tecidos moles podem facilmente desaparecer, consumido por invertebrados e bactérias, enquanto o tecido duro endurece.

A possibilidade dessa reação, pois os tecidos duros possuem um grupo de fungos adaptados a este substrato Queratinofilico fungi. Em contrate, os tecidos moles teriam apenas relativamente e recentemente mostrado por leveduras, que é um grupo particular de fungos após este desaparecimento. Igualmente, fezes, especialmente de herbívoro que suportará muito tempo é Coprophilous fungi que podem resistir, enquanto urina e fezes decompostas tem sido mostrado recentemente por leveduras. Esses dois grupos de fungos são espécies próximas, por possuir similaridades na composição e desenvolvimento. Este trabalho tem por objetivo focar os aspectos negligenciados e a sua importância forense.

A aplicação desta pesquisa na área de microbiologia forense está associada à tafonomia forense, que corresponde aos estudos dos processos de fossilização de animais e vegetal no solo.

O uso potencial de fungos na tafonomia forense originou-se de um estudo em fungos esporulentos ou experimentos com frutos no solo de florestas após a adição de uréia (ou compostos nitrogenados como a amônia).

Neste estudo encontraram condições em que alguns fungos após a decomposição do “Cadáver” e excrementos (tanto fezes como urina) e mudanças similares no solo para o tratamento com uréia ou amônia ao solo. Este processo mostra suficientemente para estabelecer o local do cadáver e dos excrementos decompostos como um novo habitat dos fungos, dando uma vantagem competitiva para um grupo especial de fungos. Porem, o tratamento do solo com uréia (ou outros compostos amoníacos) pode similar uma decomposição de um cadáver e excrementos, sendo uma das grandes perspectivas para a micologia forense. Este trabalho também discute a respostas dos fungos tratados com uréia como uma base fundamental para micologia forense.

Nesse trabalho os fungos que formaram corpos frutíferos no solo após tratamento com uréia são chamados de Ammonia fungi, e as que formaram corpos frutíferos após decomposição cadavérica e excrementos sobre condições naturais são chamadas de Post-putrfection fungi.

Sucessão Fungi:

A sucessão de fungos amoniacais visto pela seqüência reprodutiva em solos tratados com uréia:

DEUTEROMICETOS --- ASCOMUCETOS (maioria Discomicetos) --- BASIDIOMICETOS (maioria Agaricales)

Alternativamente, a sucessão pode ser dividida em primeira fase ou estágio e ultima fase ou estágio. A primeira fase (EP: EARLY PHASE) compreende em Deutoromicetos: Amblyosporium botrytis, Doratomices putredinis; Discomicetos: Ascobolus denudatus,Peziza moravecii; Agaricale: Lyophyllum tylicolor, Coprinus spp.

A ultima fase compreende em grandes e pequenos fungos como, por exemplo, Basidiomicetos: Hebeloma spp; Laccaria spp,Lyophyllum ambustum. As duas fases normalmente ocorrem descontinuamente, havendo uma interrupção entre 142 dias e 191 dias.

Fungo Pós-Putrefação (PPF) e fungos amoniacais (AF):

Crescimento de fungos em cadáveres em decomposição abandonados sobre o solo:

Cadáveres humanos e/ou animal abandonados sobre o solo se decompõe rápidamente. Por exemplo, nas estações quentes do Japão, em que temperaturas elevadas (acima de 25°C), um cadáver pode sofrer um decomposição significante em 10 dias, deixando principalmente ossos e cabelos. Imediatamente após este estágio de decomposição, próximo a esqueletização, ocorre uma fase zigomiceto: Mucor spp e/ou Rhopalomyces strangulatus nos restos mortais e em sua volta sobre o solo. Estes fungos não aparecem em solo tratado com uréia, portanto são classificados como fungos pós-putrefação (PPF) e não fungos amoniacais (AF). O aparecimento de R.strangulatus nos restos cadavéricos sobre o solo é acompanhado por um forte cheiro de carcaça apodrecida. A partir deste ponto, sucessão do fungo torna-se semelhante aos fungos que se desenvolvem em solos tratados com uréia, apresentando matriz semelhante as espécies frutíferas. Contudo, algumas espécies que não pertencem aos fungos amoniacais, como Scutellinia scutellata e Glamus pubescens, podem juntar-se a esta sucessão, como as observadas após o experimento realizado em campo. As mudanças do solo no local onde os cadáveres se decompuseram eram similar as tratadas com uréia. A mudança de cor para preto nos humos é freqüentemente misturada ao óleo ou gordura, mas devido ao fato da alcalinidade da amônia ou aminas.

Crescimento de fungos em cadáveres em decomposição enterrados:

A primeira fase da sucessão dos fungos amoniacais não é observada, a menos que o enterro tenha sido muito raso. Isto porque a primeira fase requer húmus como substrato e porque seu pseudorriza não se desenvolve, crescendo para fora do solo profundo. A cova rasa do cadáver de um mamífero, com uma cobertura de solo, por exemplo, menor que 10cm, daria origem a mais fungos amoniacais de ultima fase. Sobre uma cova funda, talvez maior que 20 cm, só estas espécies pode responder a recuperação, incluindo raízes de plantas em solos profundos e desenvolvimento de pseudorrizas, por exemplo, Hebeloma radicosoides ou H.danicum. Este fenômeno tem raízes na cultura popular e na America do norte, Hebeloma syrjense (que pode ser coespecífico com Hebeloma danicum, sendo conhecido como o identificador de cadáveres, onde parece não haver outros artigos sobre o desenvolvimento de fungos em corpos humanos enterrados. Embora não haja data na literatura em que esteja relacionada claramente com a biologia moderna.

Na vegetação não ectomirrizoides, a ultima fase é raramente observada, porque as espécies não ectomicorrizoides são raras entre os fungos de ultima fase. O tecido adiposo fica algum tempo no solo como adipocera, que possibilita auxiliar como barreira na ação de invertebrados e micróbios de solos profundos.

Crescimento de fungos sobre o solos com excrementos em decomposição:

A partir de alguns dados avaliados, é claro que excrementos humanos como fezes e urina produzem alguns fungos amoniacais, pois a sucessão fungica desenvolvidas nesse solo é parecida com as que se desenvolvem em solos tratados com uréia, embora o número de espécies encontradas em um local particular é baixo. Os guaxinins (Nyctereutes procyonoides) marcam latrinas na floresta ocupando uma área de 0,5m² ou menor. Aqui eles urinam e defecam repetidas vezes por vários anos. Tal local possibilita a produção de fungos amoniacais, mas usualmente carece de observar fungos de primeira fase em solos tratados com uréia para haver comparação entre ambos. Isto porque as excretas depositadas são repetidas. Em vez disso, alguns poucos fungos não amoniacais, por exemplo, Mucor spp e Ascobolus spp podem aparecer nas fezes delas mesmas.

A localização do local onde o excremento foi depositado e a identificação do animal que depositou o excremento são difíceis. Embora uma mudança de cor no solo, descrito anteriormente, pode ser notada. Devido estas dificuldades, muitos registros de fungos amoniacais de locais não experimentais teria sido ignorado, embora ele certamente indicasse a presença de excreção.

Desenvolvimento de fungos em solos com excrementos em decomposição enterrados:

Informações dos excrementos enterrados é disparate com alguns dados disponíveis sobre excrementos humanos enterrados, nos ninhos de vespas, nos dejetos de toupeiras, de musaranho e de dejetos de ratos do mato. Similarmente com cadáveres enterrados, estes locais são caracterizados pelo crescimento de raízes profundas de fungos ectorrizoides do gênero Hebeloma, onde também surgem na sucessão que pertence aos grupos de fungos de fase inicial (Primeira fase) de fungos amoniacais. A principal fonte de amônia, no caso de ninhos de vespas e a presença de ácido úrico contidas nas pelotas fecais excretadas pelas larvas das vespas.

Hebeloma radicosum – desenvolvem-se exclusivamente nos dejetos de topeiras (Talpidae), dejetos de musaranho (Talpidae) e nos dejetos dos ratos do mato (Muridae: Apodemus) sobre o solo é um fungo não-amoniacal. Esses fungos nunca seriam encontrados em outros substratos ou após alguns experimentos em solos tratados, pois esta reação seria mais uma proposta para uso do termo fungos pós-putrefação (PPF).

Possibilidade para a aplicação forense:

Foto 1: Hebeloma spp Foto 2: Laccaria bicolor

Ação humana ou atividades em que pode ser evidencias para o crescimento de fungos:
Exemplos de crescimentos de fungos descritos anteriormente têm mostrado que, cadáveres animais abandonados ou enterrados, pontos onde houve depósito de urina e/ou fezes pode ser detectado pela ocorrência de estruturas reprodutivas de alguns fungos específicos. Outro excelente exemplo é dado quando interpretações consideráveis de atividade humanas em que pode ser feita pela evidencias micológicas. Existem locais, onde não se é perceptível a presença de vestígios de excrementos recentes. A presença de resíduos de papeis por trás de moitas da vegetação pode ser sugestiva na ação humana em atos de urinação e defecação naquele local. A ocorrência de dois tipos de fungos amoniacais (AF) Hebeloma danicum e Laccaria bicolor confirmam a ação humana ou presença de cadáveres no local.
- Condições iniciais e a associação com o intervalo pós-deposição:
As observações nas sucessões e outras produções in situ podem uma avaliação aproximada do tempo onde o cadáver foi abandonado (IPM- Intervalo pós-morte), ou no depósito de excrementos nos dados locais. Uns exemplos realizados em trabalhos de campo com carcaça de gato observou-se o desenvolvimento de Laccaria bicolor no mês de maio-junho (início do verão), parecendo ser a primeira “Floração” da fase final na sucessão dos fungos amoniacais. Estes detalhes ajudaram estabelecer que o corpo do gato não tivesse sido enterrado por muito tempo.